分子克隆常用技術(shù)  

一、核酸的純化

　　在分子克隆的所有操作中，最基本的操作是核酸的純化。其關(guān)鍵步驟是去蛋白質(zhì)，通常只要用酚/氯仿。氯仿抽提核酸的溶液即可。每當(dāng)需要把克隆有某一些所用的酶滅活或去除以便進(jìn)行下一步時，可進(jìn)行這種抽提。然而，如要從細(xì)胞裂解液等復(fù)雜的分子混合物中純化核酸，則要先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白質(zhì)后，再用有機(jī)溶劑抽提。這些廣譜的蛋白酶包括鏈霉蛋白酶及蛋白酶K等，它們對多種天然蛋白均有活性，（1）用酚氯仿抽提：這兩種有機(jī)溶劑合用，比單獨(dú)用酚抽提的除蛋白效果更佳。繼而用氯仿抽提則可除去核酸制品中的痕量酚。①核酸樣品置有蓋小離心管中，加入等體積的酚/氯仿。②旋渦混勻管內(nèi)容物，使呈乳狀。③12000×g室溫離心15秒。④水相移入另一離心管，棄去兩相界面和有機(jī)相。⑤重復(fù)步驟①－④步操作，直至兩相界面上見不到蛋白質(zhì)為止⑦按下述核酸濃縮法沉淀回收核酸。

二、核酸的濃縮

　　應(yīng)用廣的核酸濃縮法是乙醇沉淀法。在中等濃度單價陽離子存在下，加入一定量的乙醇后，所形成有核酸沉淀可經(jīng)離心而回收，甚至對低至pg量的DNA或RNA，也可定量回收。回收的核酸可按所需濃度，再溶于適當(dāng)?shù)木彌_液中。
　　具體操作時，可向含樣品的小離心管中加入V/10單價陽離子鹽貯存液2V無水乙醇，混勻，放冰水浴中15－30min，取出目測平衡，0－4度，12000g，離心10min。吸棄上清，再另70%乙醇0.5－1ml，12000g，0－4度洗滌離心2min。吸棄上清，沉淀用油泵抽干或打開蓋子晾干后，溶于適當(dāng)體積的緩沖液中。

單價陽離子鹽溶液

*：當(dāng)加醋酸銨時，需加入DNA液的V/2。

單價陽離子鹽的選擇，主要基于下述考慮：用醋酸銨可減少dNTP的共沉淀，但在以后要作核酸的磷酸化時應(yīng)避免用醋酸銨，因銨離子是T，多核苷酸激酶的強(qiáng)烈抑制劑。當(dāng)用較高濃度的乙醇沉淀RNA時，常用LiCl，因LiCl在乙醇中溶解度很高，不隨核酸共沉淀。含有SDS的核酸樣品，應(yīng)使用NaCl，這時該去垢劑要70%乙醇中仍保持可溶。DNA和RNA沉淀，大多使用醋酸鈉（pH5.2）。

三、DNA、RNA的定量

　　準(zhǔn)確的方法是紫外分光光度法。但本法要求核酸樣品是純凈的（即無顯著的蛋白質(zhì)、酚、瓊脂糖或其它核酸、核苷酸等污染物的制品）。用紫外分光光度計(jì)測定260nm和280nm兩個波長處的光吸收，然后，按IA260相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA。40μg/ml單鏈DNA或RNA及20μg/ml單鏈寡核苷酸。計(jì)算你的樣品含量。260nm和280nm兩處讀數(shù)的比值（A260/A280），可反映核酸的純度。DNA和RNA純品的A260/A280的值分別為1.8和2.0如果樣品中有蛋白質(zhì)或酚的污染，則A260/A280將明顯低于此值，此時就無法對樣品中的核酸進(jìn)行精確定量?？蓪悠芳兓笤僮鞫繙y定。有豐富實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)的人，僅憑樣品電泳后溴化乙錠染色螢光帶的強(qiáng)度，即可大致判斷出樣品中的核酸含量，故他們常不作核酸的紫外分光光度法定量。

四、核酸的凝膠電泳和分子量參照物

（一）瓊脂糖凝膠電泳
　　可用于分離、鑒定和提純DNA片段。本法操作簡單、迅速，能分辨其它方法不能分開的DNA片段混合物，分開的DNA可用低濃度的螢光染料（0.5μg/ml溴化乙錠）染色，在紫外燈下直接觀察檢測少至1ng的DNA。
DNA通過瓊脂糖凝膠的遷移率取決于以下參數(shù)：①DNA分子的大?。壕€獎雙鏈DNA分子通過凝膠的速率與其分子量的常用對數(shù)成反比。據(jù)此用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和待測分子量的DNA片段同時電泳，比較其電泳速率，即可求出待測片段的分子大小。②瓊脂糖濃度：給定大小的DNA片段，以不同速度通過不同濃度的瓊脂擴(kuò)凝膠。因此利用不同濃度的凝膠，可分辨范圍廣泛，大小不同的DNA片段

不同濃度瓊脂糖凝膠的分離范圍

③DNA構(gòu)型：相同分子量的閉環(huán)（Ⅰ型），開環(huán)（Ⅱ型）和線狀（Ⅲ型）DNA，以不同速率通過凝膠，一般情況下，遷移率Ⅰ型>Ⅲ型>Ⅱ型。④應(yīng)用的電壓：在低電壓時，線狀DNA片段的遷移率與所用電壓成正比。但是壓增高時，大分子量DNA片段遷移率的增大是不同的，因此瓊脂糖凝膠的有效分離范圍隨電壓增大而減小。為了獲得DNA片段的最大分辨力，凝膠電泳時電壓不應(yīng)超過5V/cm。

（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳
　　可用于分析和制備小于1Kb長度的DNA片段

DNA在聚丙烯酰胺凝膠中的有效分離范圍

聚丙烯胺凝膠多用垂直平板電泳，準(zhǔn)備凝膠時，先配制30%單體母液（29克丙烯酰胺，1克雙丙烯酰胺，加水溶解，定容至100ml），再用它來配制所需濃度的凝膠。每100ml上述液體加30μl四甲基乙胺（TEMED），混勻后即可灌注于予先準(zhǔn)備好的潔凈不滲漏的凝膠玻板，待凝膠灌至近頂端時，立即插入合適的“梳子"，放室溫聚合60分鐘，若冬天室溫太低，則可放37度溫溫箱內(nèi)，以促進(jìn)聚合。聚合完成后，拔出“梳子"，將凝膠板固定于電泳槽中，向電泳槽傾入1×TBE，用滴管沖洗加樣孔和凝膠底部以除去氣泡，即可加樣電泳。一般所用電壓1-8v/cm，隨時觀察標(biāo)記染米的遷移。在溶于1×TBE的聚丙烯酰胺中，標(biāo)記染料遷移速率與下述DNA片段的速率相同

標(biāo)記染料在PAG中的遷移*

*這些數(shù)字是與染料共同遷移的DNA片段的近似大?。ㄒ?/span>bp計(jì)）。電泳結(jié)束，從電槽中取出玻板并小心地撬開，凝膠浸于溴化乙錠液（0.5μg/ml1×TBE)染色，45min后放紫外燈下觀察電泳結(jié)果。

（三）分子量參照物
　　為了判斷目的DNA片段的大小，常在同一凝膠的目的DNA旁加一分子量參照物，同時電泳并染色后，就能在紫外燈下很快知道目的片段的大小。最*用的分子量參照物是 Hind Ⅲ消化物，各片段的大小以bp表示，分別為：23130，9416，6557，4361，2322，2027，564，125。